Методические материалы, статьи

РНК: о, новый дивный мир!

Мой интерес к РНК был подогрет жарким летом 1971 года статьей в «Знание — сила» (1971, № 6), в которой рассказывалось об удивительном открытии никому до того не известного Говарда Темина из Богом забытого Висконсинского университета. Летняя отпускная эйфория стимулировала состояние ума, способствовавшее осознанию революционности события в молекулярной биологии…

А у бабочек так же

В статье, помимо всего прочего, рассказывалось и о том, что киевский генетик С. Гершензон предвосхитил своими работами открытие Темина, доказав, что генетическая информация, вернее, ее поток может быть «повернут вспять» в природе: не «ДНК — РНК — белок», а «РНК — ДНК». Сделано это было в опытах на гусеницах бабочек, которых заражали неким вирусом. Что же помешало признанию приоритета советского ученого?

Во-первых, это самоизоляция, в которой оказалась не только страна, но и ее наука. Самоизоляция политическая и интеллектуальная. Никто в мире не читает наших, немецких и французских журналов, не говоря уж о японских и китайских. Международной научной «латынью» современного мира является английский, на нем и идет общение.

Не будем забывать и о «народном академике» Т. Лысенко, и сессии ВАСХНИЛ 1948 года. Да, мы были изолированы от мира, но «там» находились Г. Гамов и М. Дельбрюк, Ш. Ауэрбах и Г. Меллер. Герман Меллер пытался спасти Вавилова и еле спасся сам, потерпев поражение от Лысенко. Шарлотту Ауэрбах спас Н. Тимофеев-Ресовский, и она осела в Эдинбурге, где основала одну из ведущих генетических школ мира (недаром именно в столице Шотландии была клонирована овечка Долли). Она знала, что после войны ее спаситель сгинул, оставив насиженное место в Бухе под Берлином. Они встретятся лишь много лет спустя. Что же до Гамова, то тут особая статья.

Гамов тоже был наслышан о «достижениях» советской агрономии, поэтому в свойственном ему юмористическом ключе иллюстрировал влияние внешней среды на наследование признаков вполне в духе Лысенко. Выступая перед генетиками и врачами одной из крупных университетских клиник, он обратил внимание собравшихся на то, что сын миссис Джонсон может быть похож на молочника Смита. Ответом физику, увлекавшемуся вопросами наследственности, был дружный смех аудитории…

И последнее. Кого тогда могли интересовать бабочки и их вирусы?

Так с помощью искусственных липосом созданные экспериментаторами короткие РНК доставляются в клетку

Темин десять лет занимался раковыми вирусами. А Штатами в шестидесятые годы после внедрения в широкую клиническую практику антибиотиков овладела идея фикс, что победа над раком тоже близка. Достаточно вспомнить, что после официального признания открытия структуры ДНК Дж. Уотсон тут же бросился в Вашингтон, где добился от администрации достойного бюджетного финансирования работ по раку. В 1972 году президент Р. Никсон, у которого от рака умерла тетка, объявил «войну раку».

В 1978 году А. Корнберг, впервые синтезировавший ДНК в пробирке, опубликовал книгу под довольно символическим названием: «Из любви к энзимам: Одиссея биохимика». Эдакая своеобразная сага из биохимии с любовью, в которой он четко заявил о том, что корни молекулярной биологии — в биохимии.

Отмахнуться от этого действительно нельзя, поскольку для успеха научного «предприятия» важна не только высокая теория, но и приземленный реалистичный принцип «кост-эффект» (соотношение цены и качества). Философия учит нас своей «теорией познания», что существует эпистемиология и онтология. Отсюда эпистолы — послания апостолов. Название происходит от греческого «эпистенай» — «на том стою!»

Нам, бросающим взгляд на историю науки, кажется, что идет поступательное и чуть ли не прямолинейное развитие. Это и есть по «теории», которая так ничего и не предсказала, и не сделала ни одного открытия.

А онтология — это низкая сущность, эдакое «аз есмь», сартровский «экзистанс», хотя она и лежит в основе высокой эпистемиологии. На самом деле, наука открывает не то, что хочет, а то, что может на данный момент. И довольно часто «проскакивает» мимо существенных и важных открытий. Это как с первой любовью, воспоминания о которой бередят потом всю жизнь душу так и не осуществленным потенциалом счастья в этой жизни-онтологии.

Заканчивая сие отступление, скажем только, что науки делятся на физические и «коллекционирование бабочек».Так вот Гершензон в силу обстоятельств оказался среди коллекционеров. А ему бы в Штаты…

Темин успел вовремя, выделив из раковых вирусов фермент, получивший название «РНК-зависимая ДНК-полимераза»: фермент, складывающий цепь ДНК по образцу — матрице РНК. Вовремя, потому что совершенно неожиданно для себя тот же фермент открыл Дэйвид Балтимор. Их статьи появились в последнем июньском номере «Нейчур» за 1970 год, после чего коллеги не стеснялись поздравлять их с совершенной революцией в науке. Через пять лет оба будут удостоены Нобелевской премии.

Назад в будущее, или обратно вперед

Через пять лет после открытия двуцепочечной спирали ДНК Ф. Крик вполне в духе теоретической физики выступил со статьей «Репликация биологических макромолекул» (то есть воспроизводство ДНК и белков). Именно в ней он постулировал необходимость посредника между ДНК и белком, поскольку к тому времени уже было известно, что белок не синтезируется в ядре, то есть там, где локализуется ДНК. На роль посредника была выдвинута РНК, получившая название «мессинджер» (от «мессидж» — послание, посыл, передающий информацию). По-русски она часто называется информационная РНК, или и-РНК.

Так родилась ЦДБ — центральная догма биологии: ДНК — РНК — белок.

А к концу 1966 года была решена одна из центральных проблем современной биологии: расшифрован код передачи информации в системе синтеза белка. Одно основание в ДНК кодировало одно основание в РНК, а три основания в РНК кодировали одну аминокислоту в молекуле белка. То есть, как часто говорилось тогда, открыт «язык жизни». А вы говорите о каких-то раковых вирусах и нарушении ЦДБ: ДНК — РНК — белок.

И все же Темин не сдавался, и в конце концов вместе с Балтимором они порушили ЦДБ. Оказалось, что управление информационными потоками может осуществляться и в обратном направлении. Уже в середине 1971 года редактор биологического отдела журнала «Нью сайентист» Г. Чедд писал, что установлено открытие РНКовой ДНК-полимеразы, которая осуществляет «обратный» синтез ДНК с РНК. Поскольку синтез нуклеиновой кислоты на матрице другой получил название «транскрипция» — «переписывание» (сравни: скриб — писец), то само явление получило название «обратная транскрипция», а фермент на научном сленге — «обратная транскриптаза», или еще проще — «ревертаза».

А кроме того, он утверждал, что есть и РНК-зависимая РНК-полимераза (РзРп — запомни, читатель, эту аббревиатуру).

Сами открыватели — Темин погибнет от опухоли мозга — надеялись, что им быстро удастся справиться с раком. Для этого всего лишь надо было найти средства, которые ингибируют — подавляют — обратную транскриптазу, играющую важную роль в процессе возникновения и развития рака. Но как много позже покажет история со СПИДом, также вызываемым ретровирусом (то есть вирусом, содержащим РНК), из этого ничего не выходит.

Разочарованные эдаким афронтом биологи попытались получить с паршивой овцы хоть шерсти клок и стали копировать с выделенных из клеток РНК-гены. Так в общем-то случайное открытие в области вирусной онкологии стало основой всей современной биотехнологии, а в конечном итоге привело и к прочтению генома человека. Но об этом мы уже неоднократно рассказывали…

3D НК

Так в переводе на современный язык выглядело бы название статьи академика В.А. Энгельгардта «Нуклеиновые кислоты — снова в трех измерениях». В ней, а также и изустно, наш патриарх молекулярной биологии рассказывал о расшифровке трехмерной структуры первой транспортной РНК, которая «транспортирует», то есть переносит в рибосому аминокислоту, благодаря чему осуществляется синтез белка.

Реклама интерферирующей РНК, созданной для борьбы с раком

Открытие было удивительно тем, что с 1953 года мы привыкли к двуцепочечности ДНК, а про РНК знали, что она одноцепочечная. Но, оказывается, РНК может самоизгибаться на себя и образовывать двуцепочечные участки. А с конца у нее свисают четыре нуклеотида. Дважды нобелевский лауреат Фред Сэнджер, вспоминая в связи с пятидесятилетним юбилеем ДНК удивительные дни начала молекулярной биологии, писал о том фуроре, который произвела расшифровка последовательности этой четверки. К 1978 году был расшифрован первый геном вируса из пяти тысяч нуклеотидов, а теперь счет идет на миллиарды, то есть объемы «чтения» увеличились в миллион раз!

А в самом начале восьмидесятых всю биологию потрясла весть о том, что РНК обладает самопроизвольной энзиматической активностью. Томас Чек выделил небольшие РНК, которые, подобно мифическому Уроборусу древних греков, «берущему себя за хвост», изгибаются и сами себя «перекусывают». И это в среде без каких бы то ни было следов присутствия белка. Нужно только присутствие металлических ионов, например того же магния или кальция.

Новые РНКовые соединения получили название «рибо-зим», то есть РНК-энзимы. Особо популярным рибозимом оказался «молотобоец», имеющий форму металлического колуна на древке.

Не будем утомлять читателя квантовыми сложностями, заметим лишь, что рибозимы могут выступать не только в рибонуклеазной, то есть расщепляющей ипостаси, но также и «сшивающей», то есть РНК-полимеразной. Такие ферменты замыкания нуклеотидной связи получили название «лигазы» (от латинского «лига» — союз, связка, узы).

Вот тут-то бы ученым и задуматься да пораскинуть мозгами. Да кому нужны были эти РНК! Биологи бросились «считывать» геном человека, под который Уотсон вновь «выбил» огромные ассигнования у конгресса США. Но не все забыли об РНК.

Л. Оргел из Биологического института в калифорнийском Сан-Диего вместе с Криком занялись разработкой проблемы панспермии, то есть космического расселения жизни. В своем продолжении идеи Вант-Гоффа они опирались на единство генетического кода у всех организмов Земли.

В какой-то мере идея опирается на экспериментальные данные. В конце 2002 года журнал «Нейчур» поместил статью о получении рибозима, состоящего всего лишь из двух букв генетического кода.

Автор статьи Дж. Ридер, работающий в том же институте Скрипса, где долгие годы изучал проблемы мозга Крик, считает, что на первых этапах эволюции химических систем очень трудно было поддерживать четырехбуквенные рибозимы. Их же искусственная система из пурина и урацила «сшивала» две молекулы РНК с катализируемой скоростью в 36 тысяч раз больше фоновой. Может, и вправду рибозимовые лигазы стояли у истоков жизни?

Рисковые аргонавты

Ясон, увлекший за собой в далекую Колхиду на поиски золотого руна своих друзей, действительно был рисковым парнем. То же можно сказать и об ученых, которые идут по неведомым дорожкам новых биотехнологических возможностей, получая и находя часто вовсе не то, что хотели и надеялись открыть.

Есть классический объект генетики растений под именем всем знакомой петунии. Окраска ее лепестков регулируется одним геном, наследование изучено вдоль и поперек. Эдакая дрозофила ботаники. Вот на этой-то дрозофиле и экспериментировали последователи «нового смелого мира».

Суть опыта заключалась во внесении дополнительных копий гена окраски. Мыслилось получить не розовые цветы, а чуть ли не черные (как это делают с тюльпанами). Но, к удивлению создателей нового ботанического Голема, петунии получились… бесцветные, то есть белые.

Анализ активности гена показал, что никакой активности не было. Гены в виде ДНК были, а вот их информационных копий (и-РНК) не было.

Когда об этом сообщили ботаники, за дело взялись «червячники». Есть такой круглый червячок — нематода — длиной-то всего лишь один миллиметр, который состоит из тысячи клеток. С. Бреннер еще в далекие шестидесятые годы распознал его генетический потенциал. Сегодня геном «кэнорабдитис элеганс» прочитан, поэтому быстро прикинуть на черве идеи не составляет труда. В общем, у червячка оказалось все то же самое.

Но в течение почти десяти лет это явление считали привилегией низших организмов. Оно получило название «интерференция» и было скопировано с известной интерференции вирусов. Еще с пятидесятых годов было известно, что вирусная атака клеток ведет не только к их гибели, но и к передаче другим клеткам сигнала об опасности. Потом в клетках выявили белок, получивший, естественно, название «интерферон». Интерференция, таким образом, мешает распространению вирусной инфекции.

Было также известно, что введение в клетки кусков нуклеиновой кислоты длиной более тридцати букв-нуклеотидов включает в их цитоплазме мощный интерфероновый ответ, блокирующий весь белковый синтез. При этом часто в экстрактах, особенно ядерных, обнаруживалась всякая РНКовая мелочь размером в какие-то 19 — 22 нуклеотида (нт). Но от нее отмахивались, считая эти супермалые РНК продуктом распада более крупных.

ДНК, намотанная на «шпульки» нуклеосом (одна видна в деталях справа внизу). Схема наглядно представляет сложнейшую систему «упаковки» ДНК, из-за чего молекулярные биологи несколько десятилетий не могли установить точную последовательность операций, совершаемых ДНК, которая переходит от плотно упакованного состояния к рабочему

И вот осенью 2001 года плотину прорвало. В лаборатории Колд-Спрингс-Харбора, где долгие годы директорствовал Уотсон, был открыт фермент «дайсер». Название образовано от английского «дайс», что означает игральные кости, случайность. Потом был открыт фермент «аргонавт», и пошло-поехало. Особенно в этом отношении постарались в Геттингене, где в Институте биофизической химии Макса Планка собралась мощная команда под руководством Томаса Тушля, открывшая РНК-интерференцию в клетках млекопитающих.

Это открытие произвело впечатление разорвавшейся бомбы. Оказалось, что в клетках высших организмов действует древняя защитная система внутриклеточного иммунитета, сохранившись в эволюционно первозданном виде. Тут уж все бодро развернулись от различных геномов и стройными рядами…

Не слышны в саду даже шорохи…

В целом весьма упрощенно картина молекулярной интерференции может быть изложена следующим образом. В клетке имеются длинные двуцепочечные молекулы РНК, на которых собираются четыре белка:

дайсер аргонавт
----------------------------
----------------------------
белок белок

При этом «дайсер» смотрит в хвост «аргонавту». Такая ориентация способствует активации «дайсера», который начинает нарезать РНК на короткие 19-22-нуклеотидные куски. Получив свой кусочек, «аргонавт» разворачивается на 180 градусов и избавляется от второй цепочки. В результате этого «аргонавт» получает санкционированный доступ в РИСК, который собирается на и-РНК-мишени.

Для пояснения дальнейшего необходимо сделать маленькое отступление. Биологам известно понятие «сайленсинг», название которого произведено от английского «сайленс» — молчание, немота, тишина. Этот термин стали применять к гену, который, отработав свое в эмбриональном развитии, замолкает на всю оставшуюся жизнь (в норме). Или, наоборот, был молчащим, а потом под действием половых гормонов бурного юношеского созревания включился и вновь замолкает лишь в старости. При раке сайленсинг многих генов снимается, что не есть хорошо.

РИСК — это «сайленсинг«-комплекс РНК-интерференции. Одноцепочечная РНК минимальной протяженности соединяется с соответствующей последовательностью и-РНК (копии гена-мишени), что является сигналом для «переваривания» последней РИСКом. От и-РНК остаются нефункциональные фрагменты. Так происходит весьма целенаправленное «замалчивание» гена без его нарушения, то есть ген «выключается» путем разрушения его информационного продукта на выходе из ядра.

Когда это впервые поняли осенью 2001 года, ажиотажу ученых не было предела, что сразу же отразилось на страницах журналов. Ведь это же великолепно! Можно извне выключать нужные вам гены и тем самым начать разбираться в их функции. Такого подарка судьбы молекулярные биологи просто не ожидали.

Дело в том, что большая часть генов в нашем геноме, прочитанном к концу 2000 года, так и не понята, то есть их функции пока еще не известны. Достаточно сказать, что на расшифровку первых тысяч генов ушла четверть века, а остается еще как минимум тысяч 25! Вот почему все заинтересованы в простом и дешевом методе, который позволит быстро определять, что делает тот или иной ген, за что он ответственен. И новая система работы РНК, по крайней мере на сегодня, представляется идеальным выходом из положения.

Это онтология нашего бытия, а что же воспаряющее сознание эпистемиологии? То есть для чего существует с незапамятных времен механизм разрушения РНК? На сегодня теоретическая мудрость гласит: механизм интерференции служит защите клетки от вторжения чужеродных вирусов. Клетка быстро синтезирует короткие РНК с помощью «дайсера», после чего РИСК осуществляет «переваривание» вторгшегося врага.

В клетках же высших существует для их генома и другая опасность, а именно транспозоны. Эти мигрирующие в геноме элементы были открыты Барбарой Маклинток, за что она была десять лет назад удостоена на склоне лет Нобелевской премии. Транспозоны могут так вклиниться в ген, что он начнет работать аномально, что приводит ко всякого рода нежелательным последствиям. И тут РНК-интерференция служит подобно управлению внутренней безопасности силовых структур.

А вирус-то не дурак

И, тем не менее, вирусные инфекции на всех уровнях живого существуют, следовательно, вирусам удается преодолеть интерференционный барьер. В свое время автор Гулливера Джонатан Свифт так обыгрывал эту ситуацию:

Натуралистами открыты
у паразитов паразиты,
И произвел переполох тот факт,
что блохи есть у блох.

Свидетельством преодоления интерференции является элегантный эксперимент, проведенный на листьях растения с помощью зеленого флюоресцирующего белка тихоокеанской медузы, включаемого белком животного вируса. Поясним, что имеется в виду.

Ген зеленого флюоресцирующего белка (ГФБ) работает в разных организмах и дает протеин, который светится зеленым под действием лазера или ультрафиолета. Клетки табака могут экспрессировать в гены вируса животного, в частности, поражающего домашнюю птицу. Так вот, в одном из подразделений Калифорнийского университета, что в городке Риверсайд, в табак внесли ген ГФБ, который, естественно, не стал светиться в силу РНК-интерференции («дайсеру» табака не важно, чью и-РНК перемалывать). Однако…

Однако через некоторое время свечение восстанавливалось. Под действием двух белков. Анализ показал, что оба они являются РНК-зависимыми РНК-полимеразами (РзРп). А мы уже эту аббревиатуру «проходили» еще в 1971 году. Вот тебе и временная петля, а отнюдь не поступательное движение вперед и ввысь!

Что делают РзРп? То же, что и в 1971 году, и миллиарды лет тому назад. Они столь же древние, как и интерференция. В клетках наблюдается баланс сдержек и противовесов, и вслед за включением интерференции вступает в действие обратный процесс, а именно восстановление двуцепочечности РНК. Интересно, что система настолько «антична», что белок животного вируса прекрасно работает в клетках растения, «зажигая» флюоресцентный белок тихоокеанской медузы. «Если звезды зажигаются, значит это кому-нибудь нужно«…

«РНКовый мир»

Книга под таким названием впервые вышла в 1993 году в издательстве Колд-Спрингс-Харбора. Авторы, среди которых был и Чек, обсуждали на страницах объемистого тома эволюционные аспекты зарождения катализа, специфичности, функции макромолекул. Четыре года назад она была переиздана. Тогда еще никто не мог предполагать взрыва интереса к РНК, и книга пользовалась интересом главным образом среди теоретиков. Теперь же совсем иное дело. Можно только поражаться провидческой способности редакторов первого издания, которые предпослали книге следующий подзаголовок: «Природа современной РНК предполагает ее пребиотичность».

С теоретической точки зрения, новое открытие позволит дедемонизировать и снять анафему с ламаркизма. «Знание — сила» уже когда-то приводил строки Мандельштама на эту тему:

Если все живое лишь помарка
за короткий выморочный день,
На подвижной лестнице Ламарка
я займу последнюю ступень.

30 лет молекулярные биологи «долбили» гены и их строение. Были созданы стройные схемы работы генов. И оказалось, что все не совсем так. Геном — совокупность всего наследственного вещества клетки — регулируется совсем не так, как представлялось при работе на отдельных выделенных генах.

Открытый новый механизм регуляции работы генов и биохимических процессов в клетке оказался очень гибким и эффективным при восприятии воздействий извне. Гибкость, приспособляемость, пластичность живой материи всегда ставила перед биологами серьезные задачи, и сейчас представляется, что сделан серьезный шаг для их решения.

Надо признаться, что автора больше волнуют не теоретические споры и дискуссии, которые интересны, но, как показывает практика, малопродуктивны в биологии, а вечный вопрос: «Ну и что?»

Автор постарался в доходчивой форме изложить состояние дел вокруг РНК, несясь, подобно серфингисту, на волне жгучего интереса, возбужденного недавним «переоткрытием» интерференции и РзРп, что можно было сделать тридцать лет назад. А далее он может сказать только словами «Книги прохладного вертограда» XVIII века, хранящейся в Российской государственной библиотеке (бывшей Ленинке): «Избранная от многих мудрецов о различных врачебных вещех, ко здравию человеческому предстоящих».

Людей прежде всего интересует, что новые открытия в биологии сулят медицине, то есть практическое внедрение. Перейдем же к прозе жизни и практике — критерию истины. Все из того же Калифорнийского университета пришло сообщение о подавлении с помощью РНК-интерференции растительного рака у томатов.

Ту же задачу охраны организма призвана решить РНК-интерференция в приложении к двум белкам ВИЧ, тем самым подавляя репликацию смертельно опасного вируса. Удалось приостановить размножение клеток глиомы, убившей Г. Темина.

Но надо признать, что пока успехи применения РНК-интерференции ограничены в основном культурами тканей. Дело в том, что до самого последнего времени РНК доставляли в клетки с помощью особых частиц — липосом, а это не всегда применимо по отношению к макроорганизму. И вот специалисты Йельского университета предложили использовать для борьбы с раковыми ретровирусами ретровирус же. Это позволяет резко расширить спектр клеток, измененных с помощью введения малых РНК. В качестве иллюстрации они в клетках селезенки выключили ген белка Т4, с помощью которого вирус иммунодефицита входит в клетки.

И это — только начало. Эра РНК еще впереди.

Игорь Лалаянц



См. также:
Игра с живым дилером
Выбираем геймплей по шансам
Повышение квалификации специалиста по закупкам
ПРОЕКТ
осуществляется
при поддержке

Окружной ресурсный центр информационных технологий (ОРЦИТ) СЗОУО г. Москвы Академия повышения квалификации и профессиональной переподготовки работников образования (АПКиППРО) АСКОН - разработчик САПР КОМПАС-3D. Группа компаний. Коломенский государственный педагогический институт (КГПИ) Информационные технологии в образовании. Международная конференция-выставка Издательский дом "СОЛОН-Пресс" Отраслевой фонд алгоритмов и программ ФГНУ "Государственный координационный центр информационных технологий" Еженедельник Издательского дома "1 сентября"  "Информатика" Московский  институт открытого образования (МИОО) Московский городской педагогический университет (МГПУ)
ГЛАВНАЯ
Участие вовсех направлениях олимпиады бесплатное

Номинант Примии Рунета 2007

Всероссийский Интернет-педсовет - 2005